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果膠酶是指分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱, 它可分 為內(nèi)切型和外切型兩大類。果膠酶廣泛應(yīng)用于果品的 加工工業(yè)中, 主要作用是果品榨汁時降低果漿泥的粘 稠度, 提高榨汁效率、出汁率、果汁澄清度和穩(wěn)定性 等。果膠酶的活力對果品的加工品質(zhì)影響很大, 因此 測定果膠酶的活力顯得尤為重要。測定酶活力的方 法主要有還原法、色原底物法、粘度法等, 其中還原 法中的 3,5 一二硝基水楊酸比色法( 簡稱 DNS 法) 具 有操作簡便, 對試劑、儀器等條件要求不高等優(yōu)點。 該方法是利用果膠酶在一定溫度、時間和條件下水 解果膠, 釋放出還原性 D- 半乳糖醛酸, 與 3,5 一二硝 基水楊酸共熱產(chǎn)生棕紅色的氨基化合物, 即發(fā)生顯 色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi), 水解生成 D- 半乳糖醛酸的 量與吸光度成正比[1~2], 與果膠酶活力成正比, 通過分光光度計測定吸光度, 可以計算出果膠酶的活力。該 方法( 又稱分光光度計法) 簡單易行, 但操作中影響 因素較多, 往往影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究就測 定中各影響因素進(jìn)行了優(yōu)化實驗, 試圖提出果膠酶 活力測定的技術(shù)參數(shù)。 1 材料與方法 1.1 材料與儀器 乙 酸 鈉 (CH3 COONa·3H2O)、 冰 乙 酸 (CH3 COOH)、*、無水亞*、酒石酸鉀鈉 (C4H4KNaO6·4H2O)、苯酚 以上試劑均為市售分析 純;3, 5 一二硝基水楊酸 ;D- 半乳糖醛酸 97%,;果 膠、果膠酶  實驗用水 均為 去離子水。UV1800PC; 電熱恒溫 水浴鍋  1.2 實驗方法 1.2.1 試劑配制 1.2.1.1 乙酸一乙酸鈉緩沖溶液 (pH4.8) 首先制備 0.2mol/L 的乙酸溶液和 0.2mol/L 的乙酸鈉溶液, 然 后將 0.2mol/L 乙酸溶液 410.0mL 與 0.2mol/L 乙酸 鈉溶液 590.0mL 混合均勻, 用酸度計測定。 1.2.1.2 DNS 試劑 (3g/L) 稱取 3.00g 3,5 一二硝基水 楊酸, 溶解于 500mL 蒸餾水中, 再逐步加入 10.4g NaOH、 91.0g C4H4KNaO6·4H2O、 2.5g 苯酚和 2.5g 無水 亞*, 溫水浴( 不超過 48℃) 中不斷攪拌, 直至溶 液清澈透明。冷卻后用蒸餾水定容至 1000mL, 保存 在棕色瓶中。 1.2.1.3 果膠底物(5g/L) 稱取 0.5g 果膠, 用 pH4.8 的緩沖液溶解, 充 分 攪 拌 后, 用 緩 沖 液 定 容 至 100mL, 置于冰箱內(nèi)冷藏(2~5℃)。 1.2.1.4 D- 半乳糖醛酸 (1mg/mL) 稱量 1.000g D- 半乳糖醛酸, 用緩沖溶液定容至 1000mL, 獲得 1mg/mL 的 D- 半乳糖醛酸溶液。

1.2.2 波長選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取 9 支 25mL 的 刻度試管編號, 并按表 1 所示加入各種試劑, 在沸水 浴中加熱 5min, 冷卻后定容至 25mL。1 號試管為標(biāo) 準(zhǔn)空白樣, 任選其它一支試管 ( 本實驗選擇 6 號試 管), 在 450～ 550nm 的范圍內(nèi)每隔 10nm 測定溶液的 吸光度。再以蒸餾水為空白樣, 在 450～ 550nm 的范圍 內(nèi)每隔 10nm 測定 1 號試管溶液的吸光度。 根據(jù)選擇的適波長, 在此波長下以 1 號試管 為標(biāo)準(zhǔn)空白樣測定其它試管內(nèi)溶液的吸光度, 利用 回歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。 1.2.3 DNS 試劑用量的選擇 如表 1 所示, 其它試劑 用量不變, 將 DNS 試劑用量設(shè)為 3 種處理, 即 1.5、 2.5、 5.0mL, 然后在適波長下測定吸光度值, 通過回 歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。根據(jù)相關(guān)系 數(shù)確定 DNS 試劑的適用量。 1.2.4 酶活力測定 1g 酶在 48℃、 pH4.8 的條件下, 1h 分解果膠產(chǎn)生 1mgD- 半乳糖醛酸為一個酶活力單 位。 1.2.4.1 酶液稀釋倍數(shù)的確定 如表 4 所示, 每處理 稱取 1g( 到 0.1mg) 酶粉( 約 2500U), 用 pH4.8 的 乙酸一乙酸鈉緩沖溶液分別稀釋到 100、 500、 1000、 2000 倍, 根據(jù)酶活力的測定結(jié)果確定適的果膠酶 稀釋倍數(shù)。 1.2.4.2 果膠底物用量的確定 果膠底物的用量如表 5 所示, 分別設(shè)置 0.2、 0.5、 0.8、 1.0、 1.5mL, 根據(jù)酶活 力的測定結(jié)果確定適的果膠用量。 1.2.4.3 酶活力測定步驟 于甲、乙兩支 25 mL 比色 管中分別加入一定量的果膠底物, 在 48℃水浴中預(yù) 熱 5min; 于甲、乙管中分別加 4 mLpH4.8 的乙酸一乙 酸鈉緩沖溶液, 甲管中加入 1mL 稀釋酶液, 立即搖 勻, 在 48℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng) 30min, 再向乙管中加 1mL 稀釋酶液, 并立即放入沸水浴中煮沸 5min, 終止 反應(yīng), 冷卻; 分別取甲、乙管中的反應(yīng)液 2mL 于兩支 25mL 比色管中, 再分別給甲、乙管加 2mL 蒸餾水, 加 入一定體積 (1.2.2 已確定的適用量)DNS 試劑, 混 合, 沸水浴煮沸 5min, 取出, 立即冷卻。加蒸餾水定容 到 25mL; 以標(biāo)準(zhǔn)空白為基準(zhǔn)調(diào)零, 在適波長處測 定兩試管的吸光度(OD 值); 用測得的(OD 甲-OD 乙) 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的 D- 半乳糖醛酸的量, 代 入下面公式計算果膠酶活力。 果膠酶活力(U):Y× N× 2/t , 其中 OD 甲- 酶樣吸光
度;OD 乙- 酶空白樣的吸光度;Y- 酶作用生成的 D- 半 乳糖醛酸(mg);N- 樣品稀釋倍數(shù);2- 測定酶活力時取 了反應(yīng)液的 1/2;t- 反應(yīng)所用時間(h)。 2 結(jié)果與分析 2.1 適波長的選擇 由圖 1 可見, 顯色劑-DNS 試劑大吸收波長為 460nm, 當(dāng)波長超過 460nm 時, DNS 試劑的光吸收急 劇減少; 而標(biāo)準(zhǔn)樣的大吸收波長為 500nm, 當(dāng)波長 超過 500nm 時隨波長增加, OD 值降低。此實驗一般 加入的 DNS 試劑量應(yīng)稍微過量, 當(dāng)波長小于 520nm 時, 過量的 DNS 試劑的光吸收增加。在比色測定中, 一般要求樣品大吸收波長與顯色劑大吸收波長 之差在 60nm 以上[3]。因此, 本方法中測定樣品的波長 應(yīng)大于或等于 520nm。 選擇 520、 530、 540nm 做為測定的波長, 按表 1 的配制方法分別繪制不同波長下的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 結(jié)果 見表 2?？梢钥闯? 540 nm 的相關(guān)系數(shù)大, 因此可 選擇 540 nm 做為適波長, 在此波長下 DNS 試劑的 吸光度值較小, 接近零, 即使 DNS 試劑過量對樣品的 吸光值影響也會較小, 而且標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光度值高于 0.2, 仍在分光光度計適宜的測量值范圍內(nèi)。
2.2 DNS 試劑用量對標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響 DNS 試劑對樣品吸光度值的影響較大, 選擇適 宜的 DNS 試劑用量尤為重要。由表 3 可知, DNS 試 劑用量為 1.5mL 和 5.0mL 時, 所得的方程相關(guān)系數(shù) 較 2.5mL 的低。由曲線的斜率可知, 少量的 DNS 試劑 使反應(yīng)產(chǎn)生的糖不能*顯色, 從而使測量的吸光度 值偏小; 而過量的 DNS 試劑由于在相同的波長條 件下 DNS 試劑的吸收值比標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸收值高, 從 而導(dǎo)致測量的吸光度值偏大。因此, 適宜的 DNS 試劑 用量為 2.5mL。
2.3 果膠酶稀釋倍數(shù)對酶活力測定值的影響 固態(tài)酶粉活力測定必須進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋[4], 稀釋酶液和底物的反應(yīng)產(chǎn)物 D- 半乳糖醛酸與 DNS 試劑顯色所得吸光度必須在 2.1 所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線范 圍內(nèi)(0.010～ 0.747), 因此, 首先必須進(jìn)行稀釋倍數(shù)實 驗。稀釋倍數(shù)及測定結(jié)果見表 4。 從表 4 可知, 當(dāng)稀釋倍數(shù)為 100 時, 酶樣吸光度 為 0.967, 超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的大值 0.747, 而且酶活 力的測定值也明顯較低; 當(dāng)稀釋倍數(shù)為 1000 時, 酶 樣吸光度為 0.509, 在標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度值的范圍內(nèi); 當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到 2000 時, 酶樣吸光度僅為 0.211, 求 得的酶活力與實際值相差甚遠(yuǎn)。由此可確定稀釋倍 數(shù)以 1000 為佳。
2.4 果膠用量對酶活力測定值的影響 果膠作為測定中的底物, 是影響測定結(jié)果的重 要因素, 果膠在反應(yīng)中應(yīng)是過量的, 但嚴(yán)重過量, 這 種膠體就會影響測定的吸光度值[5]。因為果膠中的一 些雜質(zhì)對酶活力具有抑制作用, 實驗中要選擇純度 較高的果膠底物[6]。在確定酶液稀釋 1000 倍的條件 下, 對果膠加入量的實驗結(jié)果見表 5?？梢钥闯? 果膠的加入量對空白樣品及樣品酶液的測定都有影響, 果膠加入量為 0.5～ 1.0mL 時, 測定結(jié)果相對穩(wěn)定, 加 入量為 1.5mL 時, 反應(yīng)后的溶液變得混濁, 從而影響 測定結(jié)果。為使酶與底物充分作用, 果膠加入量為 1.0mL 時測得的酶活力接近實際值, 所以本實驗確 定 1.0mL 作為底物的加入量。 3 結(jié)論 通過分光光度法測定果膠酶活力的各影響因素 的實驗研究發(fā)現(xiàn), 測量波長、 DNS 試劑用量、果膠酶 稀釋倍數(shù)以及果膠用量對酶活力測定結(jié)果都有較大 的影響。結(jié)果認(rèn)為, 在 48℃、 pH4.8 的條件下, 適宜的 測 定 波 長 為 540nm, DNS 試 劑 (3g/L) 的 用 量 為 2.5mL, 果膠酶的稀釋倍數(shù)為 1000, 果膠(5g/L) 的用 量為 1.0mL, 以此為參數(shù)測得的酶活力較為準(zhǔn)確。果膠酶是指分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱, 它可分 為內(nèi)切型和外切型兩大類。果膠酶廣泛應(yīng)用于果品的 加工工業(yè)中, 主要作用是果品榨汁時降低果漿泥的粘 稠度, 提高榨汁效率、出汁率、果汁澄清度和穩(wěn)定性 等。果膠酶的活力對果品的加工品質(zhì)影響很大, 因此 測定果膠酶的活力顯得尤為重要。測定酶活力的方 法主要有還原法、色原底物法、粘度法等, 其中還原 法中的 3,5 一二硝基水楊酸比色法( 簡稱 DNS 法) 具 有操作簡便, 對試劑、儀器等條件要求不高等優(yōu)點。 該方法是利用果膠酶在一定溫度、時間和條件下水 解果膠, 釋放出還原性 D- 半乳糖醛酸, 與 3,5 一二硝 基水楊酸共熱產(chǎn)生棕紅色的氨基化合物, 即發(fā)生顯 色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi), 水解生成 D- 半乳糖醛酸的 量與吸光度成正比[1~2], 與果膠酶活力成正比, 通過分光光度計測定吸光度, 可以計算出果膠酶的活力。該 方法( 又稱分光光度計法) 簡單易行, 但操作中影響 因素較多, 往往影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究就測 定中各影響因素進(jìn)行了優(yōu)化實驗, 試圖提出果膠酶 活力測定的技術(shù)參數(shù)。 1 材料與方法 1.1 材料與儀器 乙 酸 鈉 (CH3 COONa·3H2O)、 冰 乙 酸 (CH3 COOH)、*、無水亞*、酒石酸鉀鈉 (C4H4KNaO6·4H2O)、苯酚 以上試劑均為市售分析 純;3, 5 一二硝基水楊酸 ;D- 半乳糖醛酸 97%, 沃凱化學(xué)試劑有限公司; 果 膠、果膠酶 ; 實驗用水 均為 去離子水。 ; 電熱恒溫  1.2 實驗方法 1.2.1 試劑配制 1.2.1.1 乙酸一乙酸鈉緩沖溶液 (pH4.8) 首先制備 0.2mol/L 的乙酸溶液和 0.2mol/L 的乙酸鈉溶液, 然 后將 0.2mol/L 乙酸溶液 410.0mL 與 0.2mol/L 乙酸 鈉溶液 590.0mL 混合均勻, 用酸度計測定。 1.2.1.2 DNS 試劑 (3g/L) 稱取 3.00g 3,5 一二硝基水 楊酸, 溶解于 500mL 蒸餾水中, 再逐步加入 10.4g NaOH、 91.0g C4H4KNaO6·4H2O、 2.5g 苯酚和 2.5g 無水 亞*, 溫水浴( 不超過 48℃) 中不斷攪拌, 直至溶 液清澈透明。冷卻后用蒸餾水定容至 1000mL, 保存 在棕色瓶中。 1.2.1.3 果膠底物(5g/L) 稱取 0.5g 果膠, 用 pH4.8 的緩沖液溶解, 充 分 攪 拌 后, 用 緩 沖 液 定 容 至 100mL, 置于冰箱內(nèi)冷藏(2~5℃)。 1.2.1.4 D- 半乳糖醛酸 (1mg/mL) 稱量 1.000g D- 半乳糖醛酸, 用緩沖溶液定容至 1000mL, 獲得 1mg/mL 的 D- 半乳糖醛酸溶液。

1.2.2 波長選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取 9 支 25mL 的 刻度試管編號, 并按表 1 所示加入各種試劑, 在沸水 浴中加熱 5min, 冷卻后定容至 25mL。1 號試管為標(biāo) 準(zhǔn)空白樣, 任選其它一支試管 ( 本實驗選擇 6 號試 管), 在 450～ 550nm 的范圍內(nèi)每隔 10nm 測定溶液的 吸光度。再以蒸餾水為空白樣, 在 450～ 550nm 的范圍 內(nèi)每隔 10nm 測定 1 號試管溶液的吸光度。 根據(jù)選擇的適波長, 在此波長下以 1 號試管 為標(biāo)準(zhǔn)空白樣測定其它試管內(nèi)溶液的吸光度, 利用 回歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。 1.2.3 DNS 試劑用量的選擇 如表 1 所示, 其它試劑 用量不變, 將 DNS 試劑用量設(shè)為 3 種處理, 即 1.5、 2.5、 5.0mL, 然后在適波長下測定吸光度值, 通過回 歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。根據(jù)相關(guān)系 數(shù)確定 DNS 試劑的適用量。 1.2.4 酶活力測定 1g 酶在 48℃、 pH4.8 的條件下, 1h 分解果膠產(chǎn)生 1mgD- 半乳糖醛酸為一個酶活力單 位。 1.2.4.1 酶液稀釋倍數(shù)的確定 如表 4 所示, 每處理 稱取 1g( 到 0.1mg) 酶粉( 約 2500U), 用 pH4.8 的 乙酸一乙酸鈉緩沖溶液分別稀釋到 100、 500、 1000、 2000 倍, 根據(jù)酶活力的測定結(jié)果確定適的果膠酶 稀釋倍數(shù)。 1.2.4.2 果膠底物用量的確定 果膠底物的用量如表 5 所示, 分別設(shè)置 0.2、 0.5、 0.8、 1.0、 1.5mL, 根據(jù)酶活 力的測定結(jié)果確定適的果膠用量。 1.2.4.3 酶活力測定步驟 于甲、乙兩支 25 mL 比色 管中分別加入一定量的果膠底物, 在 48℃水浴中預(yù) 熱 5min; 于甲、乙管中分別加 4 mLpH4.8 的乙酸一乙 酸鈉緩沖溶液, 甲管中加入 1mL 稀釋酶液, 立即搖 勻, 在 48℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng) 30min, 再向乙管中加 1mL 稀釋酶液, 并立即放入沸水浴中煮沸 5min, 終止 反應(yīng), 冷卻; 分別取甲、乙管中的反應(yīng)液 2mL 于兩支 25mL 比色管中, 再分別給甲、乙管加 2mL 蒸餾水, 加 入一定體積 (1.2.2 已確定的適用量)DNS 試劑, 混 合, 沸水浴煮沸 5min, 取出, 立即冷卻。加蒸餾水定容 到 25mL; 以標(biāo)準(zhǔn)空白為基準(zhǔn)調(diào)零, 在適波長處測 定兩試管的吸光度(OD 值); 用測得的(OD 甲-OD 乙) 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的 D- 半乳糖醛酸的量, 代 入下面公式計算果膠酶活力。 果膠酶活力(U):Y× N× 2/t , 其中 OD 甲- 酶樣吸光
度;OD 乙- 酶空白樣的吸光度;Y- 酶作用生成的 D- 半 乳糖醛酸(mg);N- 樣品稀釋倍數(shù);2- 測定酶活力時取 了反應(yīng)液的 1/2;t- 反應(yīng)所用時間(h)。 2 結(jié)果與分析 2.1 適波長的選擇 由圖 1 可見, 顯色劑-DNS 試劑大吸收波長為 460nm, 當(dāng)波長超過 460nm 時, DNS 試劑的光吸收急 劇減少; 而標(biāo)準(zhǔn)樣的大吸收波長為 500nm, 當(dāng)波長 超過 500nm 時隨波長增加, OD 值降低。此實驗一般 加入的 DNS 試劑量應(yīng)稍微過量, 當(dāng)波長小于 520nm 時, 過量的 DNS 試劑的光吸收增加。在比色測定中, 一般要求樣品大吸收波長與顯色劑大吸收波長 之差在 60nm 以上[3]。因此, 本方法中測定樣品的波長 應(yīng)大于或等于 520nm。 選擇 520、 530、 540nm 做為測定的波長, 按表 1 的配制方法分別繪制不同波長下的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 結(jié)果 見表 2。可以看出, 540 nm 的相關(guān)系數(shù)大, 因此可 選擇 540 nm 做為適波長, 在此波長下 DNS 試劑的 吸光度值較小, 接近零, 即使 DNS 試劑過量對樣品的 吸光值影響也會較小, 而且標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光度值高于 0.2, 仍在分光光度計適宜的測量值范圍內(nèi)。
2.2 DNS 試劑用量對標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響 DNS 試劑對樣品吸光度值的影響較大, 選擇適 宜的 DNS 試劑用量尤為重要。由表 3 可知, DNS 試 劑用量為 1.5mL 和 5.0mL 時, 所得的方程相關(guān)系數(shù) 較 2.5mL 的低。由曲線的斜率可知, 少量的 DNS 試劑 使反應(yīng)產(chǎn)生的糖不能*顯色, 從而使測量的吸光度 值偏小; 而過量的 DNS 試劑由于在相同的波長條 件下 DNS 試劑的吸收值比標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸收值高, 從 而導(dǎo)致測量的吸光度值偏大。因此, 適宜的 DNS 試劑 用量為 2.5mL。
2.3 果膠酶稀釋倍數(shù)對酶活力測定值的影響 固態(tài)酶粉活力測定必須進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋[4], 稀釋酶液和底物的反應(yīng)產(chǎn)物 D- 半乳糖醛酸與 DNS 試劑顯色所得吸光度必須在 2.1 所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線范 圍內(nèi)(0.010～ 0.747), 因此, 首先必須進(jìn)行稀釋倍數(shù)實 驗。稀釋倍數(shù)及測定結(jié)果見表 4。 從表 4 可知, 當(dāng)稀釋倍數(shù)為 100 時, 酶樣吸光度 為 0.967, 超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的大值 0.747, 而且酶活 力的測定值也明顯較低; 當(dāng)稀釋倍數(shù)為 1000 時, 酶 樣吸光度為 0.509, 在標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度值的范圍內(nèi); 當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到 2000 時, 酶樣吸光度僅為 0.211, 求 得的酶活力與實際值相差甚遠(yuǎn)。由此可確定稀釋倍 數(shù)以 1000 為佳。
2.4 果膠用量對酶活力測定值的影響 果膠作為測定中的底物, 是影響測定結(jié)果的重 要因素, 果膠在反應(yīng)中應(yīng)是過量的, 但嚴(yán)重過量, 這 種膠體就會影響測定的吸光度值[5]。因為果膠中的一 些雜質(zhì)對酶活力具有抑制作用, 實驗中要選擇純度 較高的果膠底物[6]。在確定酶液稀釋 1000 倍的條件 下, 對果膠加入量的實驗結(jié)果見表 5?？梢钥闯? 果膠的加入量對空白樣品及樣品酶液的測定都有影響, 果膠加入量為 0.5～ 1.0mL 時, 測定結(jié)果相對穩(wěn)定, 加 入量為 1.5mL 時, 反應(yīng)后的溶液變得混濁, 從而影響 測定結(jié)果。為使酶與底物充分作用, 果膠加入量為 1.0mL 時測得的酶活力接近實際值, 所以本實驗確 定 1.0mL 作為底物的加入量。 3 結(jié)論 通過分光光度法測定果膠酶活力的各影響因素 的實驗研究發(fā)現(xiàn), 測量波長、 DNS 試劑用量、果膠酶 稀釋倍數(shù)以及果膠用量對酶活力測定結(jié)果都有較大 的影響。結(jié)果認(rèn)為, 在 48℃、 pH4.8 的條件下, 適宜的 測 定 波 長 為 540nm, DNS 試 劑 (3g/L) 的 用 量 為 2.5mL, 果膠酶的稀釋倍數(shù)為 1000, 果膠(5g/L) 的用 量為 1.0mL, 以此為參數(shù)測得的酶活力較為準(zhǔn)確。